Diversité des champignons endophytes mycorhiziens et de classe II chez le pois chiche, et influence du génotype de la plante

réalisé en cotutelle avec la Faculté des Sciences de Tunis, Université Tunis El Manar.

Contribution des légumineuses, des champignons endophytes et mycorhiziens dans la nutrition azotée des prairies indigènes semi-arides

Les prairies indigènes présentent une source importante d'alimentation pour le pâturage du bétail dans les prairies Canadiennes semi-arides. L'addition de légumineuses fixatrices d'azote et de phosphore dans les prairies indigènes peut améliorer la productivité et la valeur nutritive de fourrage. Ces pratiques peuvent induire des modifications de la structure et de la diversité des communautés fongiques du sol, ce qui peut en retour avoir un impact sur la production et le contenu nutritionnel du fourrage. L’objectif de cette étude était de développer un système de pâturage à bas niveau d’intrants, productif, autonome et durable. À court terme, nous voulions 1) déterminer l'effet des légumineuses (Medicago sativa, une légumineuse cultivée ou Dalea purpurea, une légumineuse indigène) et la fertilité en phosphore du sol sur la productivité et la valeur nutritive des graminées indigènes, comparées avec celles de la graminée introduite Bromus biebersteinii en mélange avec le M. sativa, 2) identifier l'effet de ces pratiques sur la diversité et la structure des communautés des champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) et des champignons totaux, 3) identifier l'effet des légumineuses et des CMA sur les interactions compétitives entre les graminées de saison fraîche et les graminées de saison chaude. Les expériences menées au champ ont montré que M. sativa améliorait les teneurs en azote et en phosphore des graminées indigènes au début de l'été, ainsi que la teneur en azote de la graminée de saison chaude Bouteloua gracilis à la fin de l'été de l'année sèche 2009. Par contre, la fertilité en phosphore du sol n'ait pas affecté la productivité des plantes. D'autre part, l'inclusion des légumineuses augmentait la diversité des CMA dans le mélange de graminées indigènes. Cette modification présentait des corrélations positives avec la productivité et la quantité totale d'azote chez le M. sativa et avec la teneur en phosphore des graminées indigènes, au début de l'été. La structure des communautés de champignons totaux était influencée par l'interaction entre le mélange des espèces et la fertilité en phosphore du sol seulement en 2008 (année humide). Cet effet pourrait être lié en partie avec la productivité des plantes et l'humidité du sol. Les expériences menées en chambre de culture ont montré que les CMA peuvent favoriser la productivité des graminées de saison chaude au détriment des graminées de saison fraîche. En effet, Glomus cubense augmentait la productivité de la graminée de saison chaude B. gracilis, en présence de M. sativa. Cet effet pourrait être associé à l’effet négatif du G. cubense sur la fixation de l’azote par le M. sativa et à la diminution de l’efficacité d’utilisation de l'azote de certaines graminées de saison fraîche résultant en une augmentation de la disponibilité de l'azote pour B. gracilis. Par contre, le Glomus sp. augmentait la biomasse de Schizachyrium scoparium, autre graminée de saison chaude, en absence de légumineuse. Ce phénomène pourrait être attribuable à une amélioration de l’efficacité d’utilisation du P de cette graminée. En conclusion, mes travaux de recherche ont montré que la légumineuse cultivée M. sativa peut améliorer la valeur nutritive des graminées indigènes au début de l'été ainsi que celle de la graminée de saison chaude B. gracilis, dans des conditions de sécheresse sévère de la fin de l'été. De plus, l'addition de M. sativa dans le mélange de graminées indigènes peut contribuer à augmenter le nombre des espèces bénéfiques des CMA pour la production et la nutrition du fourrage au début de l'été.

Diversité des organismes endophytes dans les racines de plantes poussant en milieu contaminé en hydrocarbures

Les champignons endophytes sont des organismes qui vivent à l’intérieur de plantes sans causer de symptômes de maladie apparents. Ils sont trouvés dans virtuellement toutes plante, et la nature des interactions peut aller de mutualiste à pathogène dépendant des conditions. La diversité et la structure des communautés des champignons endophytes dans les plantes poussant en milieu extrêmement pollué, ainsi que leur rôle potentiel pour améliorer la phytorémédiation, demeurent peu compris. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux communautés de champignons endophytes de racines de deux espèces de plantes (Eleocharis erythropoda et Populus sp.). Ces espèces poussaient de manière spontanée dans trois bassins de sédimentation d’un ancienne usine pétro-chimique ayant des niveaux de contaminations différents, en utilisant à la fois une approche d’isolation d’organisme ainsi que des analyses de pyroséquençage de l’ITS d’ADN ribosomal. Nos résultats indiquent que les niveaux de contamination ont un effet significatif sur la composition taxonomique des champignons endophytes des racines de E. erythropoda. Une majorité des données de séquences appartiennent à la classe des Dothideomycetes dans les échantillons de forte concentration en hydrocarbures pétroliers, dont une majorité appartient au genre Alternaria. La comparaison des données d’isolation et de pyroséquençage suggère que l’isolation de souches ne permet pas l’obtention des souches les plus représentées dans les données de pyroséquençage. Ces résultats pourront potentiellement aider à l’élaboration de stratégies pour améliorer la phytorémédiation en utilisant les champignons endophytes.

Transcriptome analysis of Neotyphodium and Epichloë grass endophytes

Large-scale gene discovery has been performed for the grass fungal endophytes Neotyphodium coenophialum, Neotyphodium lolii, and Epichloë festucae. The resulting sequences have been annotated by comparison with public DNA and protein sequence databases and using intermediate gene ontology annotation tools. Endophyte sequences have also been analysed for the presence of simple sequence repeat and single nucleotide polymorphism molecular genetic markers. Sequences and annotation are maintained within a MySQL database that may be queried using a custom web interface. Two cDNA-based microarrays have been generated from this genome resource. They permit the interrogation of 3806 Neotyphodium genes (NchipTM microarray), and 4195 Neotyphodium and 920 Epichloë genes (EndoChipTM microarray), respectively. These microarrays provide tools for high-throughput transcriptome analysis, including genome-specific gene expression studies, profiling of novel endophyte genes, and investigation of the host grass–symbiont interaction. Comparative transcriptome analysis in Neotyphodium and Epichloë was performed

Genetic diversity of root-associated fungal endophytes from Calluna vulgaris at contrasting field sites

A total of 107 putative ericoid mycorrhizal endophytes were isolated from hair roots of Calluna vulgaris from two abandoned arsenic/copper mine sites and a natural heathland site in southwest England. The endophytes were initially grouped as 14 RFLP types, based on the results of ITS-RFLP analysis using the restriction endonucleases Hinf I, Rsa I and Hae III. ITS sequences were obtained for representative isolates from each RFLP type and compared phylogenetically with sequences for known ericoid mycorrhizal endophytes and selected ascomycetes. The majority of endophyte isolates (62-92%) from each site were identified as Hymenoscyphus ericae, but a number of other less common mycorrhizal RFLP types were also identified, all of which appear to have strong affinities with the order Leotiales. None of the less common RFLP types was isolated from C. vulgaris at more than one field site. Neighbour-joining analysis indicated similarities between the endophytes from C. vulgaris and mycorrhizal endophytes isolated from other Ericaceae and Epacridaceae hosts in North America and Australia.

Intoxication par les champignons [Mushroom poisoning].

Mushroom poisoning is a regular complaint for consultation in emergency facilities. These situations are usually benign and symptomatic treatment is sufficient. However, severe damage can occur, potentially life-threatening. We review the various syndromes associated with the toxins involved, their management and the major signs that are suggestive of serious injury and requiring hospitalization.

Étude du polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline chez des espèces de champignons mycorhiziens à arbuscules en vue de développer des marqueurs moléculaires

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA), classés dans le phylum Glomeromycota, ne peuvent pas être facilement identifiés par la morphologie de leurs spores et leurs mycélia à l'intérieur ou à l'extérieur des racines de leurs hôtes. Ce problème fondamental d'identification rend l'étude de leur diversité, en particulier dans leur habitat naturel (sol et racine) extrêmement difficile. Les gènes ribosomaux ont été largement utilisés pour développer des amorces spécifiques et en inférer des arbres phylogénétiques. Cependant, ces gènes sont très polymorphes et existent en plusieurs copies dans le génome des CMA, ce qui complique l’interprétation des résultats. Dans notre étude, nous avons étudié le polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline, présent en faible nombre de copies dans le génome des CMA, afin d’obtenir de nouvelles séquences nucléotidiques pour développer des marqueurs moléculaires. Les gènes β-tubuline amplifiés à partir de l'ADN génomique de cinq espèces du genre Glomus ont été clonés et séquencés. L’analyse des séquences indique un polymorphisme intraspécifique chez trois espèces de CMA. Deux séquences paralogues très variables ont été nouvellement identifiées chez les G. aggregatum, G. fasciculatum et G. cerebriforme. Aucun polymorphisme n’a été détecté chez les G. clarum et G. etunicatum. Toutes les séquences montrent la présence de deux introns hautement variables. La majorité des substitutions ont été localisées dans les exons et sont synonymes à 90%. La conservation des acides aminés suggère un niveau élevé de sélection négative sur le gène β-tubuline et nous permet de confirmer que les CMA représentent un ancien groupe fongique (400 million d’années). L’analyse phylogénétique, réalisée avec vingt et une séquences nucléotidiques du gène β-tubuline, a révélé que les séquences des Glomaceae forment un groupe monophylétique bien supporté, avec les Acaulosporaceae et Gigasporaceae comme groupe frère. Les séquences paralogues nouvellement identifiées chez les G. aggregatum et G. fasciculatum n'ont pas été monophylétiques au sein de chaque espèce. Les oligonucléotides ont été choisis sur la base des régions variables et conservées du gène β-tubuline. Le test PCR des amorces β-Tub.cerb.F/ β-Tub.cerb.R a révélé des bandes spécifiques de 401 pb pour les séquences paralogues du G. cerebriforme. Deux paires d’amorces ont été développées afin d’identifier les séquences du groupe nommé Tub.1. Les tests PCR nous ont permis d’identifier certaines séquences du groupe Tub.1. Une paire d’amorce β-Tub.2.F/ β-Tub.2.R nous a permis d’identifier certaines séquences paralogues du groupe nommé Tub.2. L’analyse d’autres gènes combinée à celle du gène β-tubuline permettra le développement de marqueurs moléculaires plus spécifiques pour l’identification de CMA.

Reproduction et échanges génétiques horizontaux chez les champignons mycorhiziens à arbuscules

3 vidéos sont dans des fichiers complémentaires à ce mémoire

Développement et évaluation de méthodes d'isolation des spores de champignons contenues dans l'eau des rivières

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Développement des marqueurs moléculaires spécifiques pour l'identification et la quantification de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires en utilisant la PCR en temps réel

Les champignons mycorhizien à arbuscules (CMA) sont des organismes pouvant établir des symbioses avec 80% des plantes terrestres. Les avantages d'une telle symbiose sont de plus en plus caractérisés et exploités en agriculture. Par contre, jusqu'à maintenant, il n'existe aucun outil permettant à la fois l'identification et la quantification de ces champignons dans le sol de façon fiable et rapide. Un tel outil permettrait, entre autres, de mieux comprendre les dynamiques des populations des endomycorhizes dans le sol. Pour les producteurs d'inoculum mycorhiziens, cela permettrait également d'établir un suivi de leurs produits en champs et d'avoir un contrôle de qualité de plus sur leurs inoculants. C'est ce que nous avons tenté de développer au sein du laboratoire du Dr. Hijri. Depuis environ une trentaine d'années, des outils d'identification et/ou de quantification ont été développés en utilisant les profiles d'acides gras, les isozymes, les anticorps et finalement l'ADN nucléaire. À ce jour, ces méthodes d’identification et de quantification sont soit coûteuses, soit imprécises. Qui plus est, aucune méthode ne permet à la fois la quantification et l’identification de souches particulières de CMA. L’ADN mitochondrial ne présente pas le même polymorphisme de séquence que celui qui rend l’ADN nucléaire impropre à la quantification. C'est pourquoi nous avons analysé les séquences d’ADN mitochondrial et sélectionné les régions caractéristiques de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). C’est à partir de ces régions que nous avons développé des marqueurs moléculaires sous forme de sondes et d’amorces TaqMan permettant de quantifier le nombre de mitochondries de chacune de ces espèces dans un échantillon d’ADN. Nous avons ensuite tenté de déterminer une unité de quantification des CMA, soit un nombre de mitochondries par spore. C’est alors que nous avons réalisé que la méthode de préparation des échantillons de spores ainsi que la méthode d’extraction d’ADN avaient des effets significatifs sur l’unité de quantification de base. Nous avons donc optimisé ces protocoles, avant d’en e tester l’application sur des échantillons de sol et de racines ayant été inoculés avec chacune des deux espèces cibles. À ce stade, cet outil est toujours semi-quantificatif, mais il permet 9 l’identification précise de deux espèces de CMA compétentes dans des milieux saturés en phosphore inorganique. Ces résultats , en plus d’être prometteurs, ont permis d’augmenter les connaissances méthodologiques reliées à la quantification des CMA dans le sol, et suggèrent qu’à cause de leurs morphologies différentes, l’élaboration d’un protocole de quantification standardisé pour toutes les espèces de CMA demeure un objectif complexe, qui demande de nouvelles études in vivo.

Botrytis species: relentless necrotrophic thugs or endophytes gone rogue?

Plant pathology has a long-standing tradition of classifying microbes as pathogens, endophytes or saprophytes. Lifestyles of pathogens are categorized as biotrophic, necrotrophic or hemibiotrophic. Botrytis species are considered by many to be archetypal examples of necrotrophic fungi, with B. cinerea being the most extensively studied species because of its broad host range and economic impact. In this review, we discuss recent work which illustrates that B. cinerea is capable of colonizing plants internally, presumably as an endophyte, without causing any disease or stress symptoms. The extent of the facultative endophytic behaviour of B. cinerea and its relevance in the ecology and disease epidemiology may be vastly underestimated. Moreover, we discuss the recent discovery of a novel Botrytis species, B. deweyae, which normally grows as an endophyte in ornamental daylilies (Hemerocallis), but displays facultative pathogenic behaviour, and is increasingly causing economic damage. We propose that the emergence of endophytes ‘gone rogue’ as novel diseases may be related to increased inbreeding of hybrid lines and reduced genetic diversity. These observations lead us to argue that the sometimes inflexible classification of pathogenic microbes by their lifestyles requires serious reconsideration. There is much more variety to the interactions of Botrytis with its hosts than the eye (or the plant pathologist) can see, and this may be true for other microbes interacting with plants.

Wheat seed embryo excision enables the creation of axenic seedlings and Koch’s postulates testing of putative bacterial endophytes

Early establishment of endophytes can play a role in pathogen suppression and improve seedling development. One route for establishment of endophytes in seedlings is transmission of bacteria from the parent plant to the seedling via the seed. In wheat seeds, it is not clear whether this transmission route exists, and the identities and location of bacteria within wheat seeds are unknown. We identified bacteria in the wheat (Triticum aestivum) cv. Hereward seed environment using embryo excision to determine the location of the bacterial load. Axenic wheat seedlings obtained with this method were subsequently used to screen a putative endophyte bacterial isolate library for endophytic competency. This absence of bacteria recovered from seeds indicated low bacterial abundance and/or the presence of inhibitors. Diversity of readily culturable bacteria in seeds was low with 8 genera identified, dominated by Erwinia and Paenibacillus. We propose that anatomical restrictions in wheat limit embryo associated vertical transmission, and that bacterial load is carried in the seed coat, crease tissue and endosperm. This finding facilitates the creation of axenic wheat plants to test competency of putative endophytes and also provides a platform for endophyte competition, plant growth, and gene expression studies without an indigenous bacterial background.